وانات آلوده را به منظور كنترل نئوسپورا کانينوم در سطح گله داشته باشند ضروري به نظر مي رسد.

از زمان شناسايي نئوسپورا کانينوم تاكنون روشهاي تشخيصي زيادي براي شناسايي آلودگي دامها به اين انگل ابداع شده است. از اين ميان مي توان به روشهاي هيستوپاتولوژي، ايمونوهيستوشيمي، سرولوژي، مولكولي، كشت سلولي و استفاده از حيوانات آزمايشگاهي اشاره نمو د

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )

تشخيص قطعي بر اساس آزمايش ايمونوهيستوشيمي بافتهاي آلوده است. اين روش معمولاﹰ براي تأييد ساير روشها و نيز براي تفکيک نئوسپورا کانينوم از توکسوپلاسما گندئي استفاده شده اما روشي وقت گير بوده و تفسير نتايج آن مشکل است

 (Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

تشخيص آلودگي عمدتا با روشهاي سرولوژيکي، به عنوان ابزار مهمي براي بررسي هاي کلينيکي و اپيدميولوژيکي، انجام مي شود (et al. 2007 Silva).

آزمايشات سرولوژيك داراي اين مزيت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافي در مورد مرحله آلودگي فراهم مي سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجايي که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانينوم، حضور آنتي بادي هاي اختصاصي در سرم گاو است، روشهاي مختلف سرولوژيک براي تشخيص آنتي بادي به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الايزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در اين روشها از تاکي زوئيت کامل يا آنتي ژن هاي مشتق شده از تاکي زوئيت استفاده مي شود که به علت واکنش متقاطع با ساير انگلهاي مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئي باعث واکنش مثبت کاذب مي شود

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنين به علت نياز اين آزمايشات به استفاده از مقادير زياد آنتي ژنهاي مشتق شده از کشت سلولي، اغلب تهيه آنتي ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دليل تفاوت در ميزان بقاياي سلول ميزبان بر اختصاصيت و تکرارپذيري نتايج تست تاثير مي گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراين ضروري است که تست تشخيصي مطمئن، حساس و اختصاصي با استفاده از آنتي ژن هاي اختصاصي نئوسپورا کانينوم طراحي شود.

آنتي ژن هاي نوترکيب درمقايسه با آنتي ژن هاي کامل، مزاياي بيشتري دارند زيرا اولا به آساني درحجم زياد تهيه مي شوند و ثانيا به راحتي براي آزمايشات تشخيصي استاندارد مي شوند. بنابراين با به كارگيري اين آنتي ژن ها، نيازي به آنتي ژن هاي مشتق شده از کشت سلولي نيست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).

تاکنون چندين آنتي ژن نئوسپورا کانينوم شناسايي شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئين هايي هستند که روي سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر مي شوند مانند  NcSAG1و  NcSRS2که از آنتي ژن هاي سطحي ايمونودومينانت اصلي هستند
(immunodominant surface antigens  major). علاوه بر اين ، آنتي ژن هايي نيز هستند که بطور موقتي روي سطح تاکي زوئيت هاي انگل ظاهر مي شوند مانند محتويات ميکرونم، راپتري و گرانولهاي متراکم. اين ها ارگانل هاي ترشحي در ناحيه قدامي مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهاي فيزيکي مستقيم بين انگل و سلول ميزبان نقش دارند
( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b;  Liddell Lally et al. 1997;  Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).  

اگرچه NcSAG1 و  NcSRS2 بطور واضح با همتاهاي خود در توکسوپلاسما گندئي (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما ميزان تشابه توالي به اندازه اي نيست که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از اين رو به عنوان مارکرهاي تشخيصي عالي براي تمايز موثر بين نئوسپورا کانينوم و توکسوپلاسما گندئي قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنين پاسخهاي ايمني القاء شده توسط اين آنتي ژن هاي سطحي، آنها را به مارکرهاي ايده آل براي تشخيص سرولوژيکي آلودگي به نئوسپورا کانينوم و تهيه واکسن تبديل كرده است

Chahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).

تست الايزا با استفاده از آنتي ژن هاي tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t براي تشخيص نئوسپورا کانينوم طراحي و مورد استفاده قرار گرفته است و نتايج نشان مي دهد که اين تست، حساسيت و اختصاصيت بالايي دارد و واکنش متقاطعي با سرم مثبت  توکسوپلاسما گندئي ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005;  Ahn et al. 2003; ).

اكثر تستهاي تشخيصي به صورت كيت هاي تجاري وارداتي، پرهزينه و وقت گيرهستند و به مواد و ابزارخاصي نيز نياز دارند که آن ها را براي کاربرد فيلدي و کلينيکي نامناسب مي سازند (et al. 2005  Chahan et al. 2003; Liao )، از اين رو طراحي و ارزيابي تست تشخيصي با حساسيت و اختصاصيت بالا كه به ابزار اختصاصي پيشرفته نياز نداشته باشد و در عين حال سريع و آسان انجام شود ضروري است.

 تست لاتکس آگلوتيناسيون LAT)) يکي از راحت ترين تستهاي تشخيصي است و در حال حاضر به عنوان يک تست تجاري در دسترس براي تشخيص توکسوپلاسما گندئي استفاده مي شود ( et al. 2004  Huang). در تحقيقي از تست لاتکس آگلوتيناسيون LAT)) با  آنتي ژن نوترکيب TgMIC3 براي تشخيص سرولوژيکي توکسوپلاسما گندئي استفاده شده که به علت اختصاصيت بالا ، کاربرد سريع و ساده،کم هزينه بودن و مناسب  براي استاندارد شدن، روش تشخيصي مناسبي گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از اين تست براي تشخيص نئوسپورا کانينوم استفاده نشده ولي از آنجايي که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانينوم واکنش متقاطع مي دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقيق حاضر از NcSAG1 نوترکيب به عنوان آنتي ژن براي تشخيص آنتي بادي ضد نئوسپورا کانينوم در گاو استفاده شد (2005 et al.  Chahan et al. 2003; Liao).

هدف از اين تحقيق طراحي و استاندارد کردن تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT)) بر اساس آنتي ژن نوترکيب   NcSAG1 براي تشخيص سرولوژيکي نئوسپورا کانينوم و مقايسه ي ارزش تشخيصي اين تست با کيت تجاري الايزا است.

کليات

1-2- تاريخچه

 نئوسپورا کانينوم (Neospora caninum)  تک ياخته داخل سلولي اجباري از شاخه آپي کمپلکسا (Apicomplexa) و بسيار شبيه توکسوپلاسما گندئي (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ هاي نروژي داراي علائم عصبي مانند آنسفاليت و فلجي اندام هاي حركتي انگلي شبيه به توكسوپلاسما گندئي گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله هاي مبتلا به ميلوآنسفاليت مشاهده گرديد ( Anderson et al. 2000).

در يك مطالعه گذشته نگر مقاطع آسيب شناسي، نشانه هاي باليني و اطلاعات آزمايشگاهي ثبت شده از 23 سگ نروژي كه در آنها يك بيماري مانند توكسوپلاسموزيس تشخيص داده شده بود را مورد بررسي و با ميكروسكوپ نوري و الكتروني مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بيماري توكسوپلاسما گندئي تشخيص داده شد، اما در 10 مورد ديگر از سگ ها يك جنس جديد به نام نئوسپورا و گونه اي به نام نئوسپورا كانينوم كه از نظر ساختماني و آنتي ژني متفاوت از توكسوپلاسما گندئي بود، تشخيص داده شد. به اين دليل اين انگل نئوسپورا نام گرفت كه از لحاظ سير تكاملي و ريخت شناسي مشابه با ساير اعضاي دسته اسپوروزوآ (Sporozoea) بود و چون براي اولين بار تشخيص داده مي شد انگل هاگ دار جديد يا نئوسپورا نام گرفت (2003b; Dubey et al. 1988 Dubey).

تا مدت ها سير تكاملي اين انگل كاملاً روشن نبود و ميزبان نهايي آن شناسايي نشده بود و تنها حدس زده مي شد كه به دليل شباهت هايي كه با خانواده ساركوسيستيده (Sarcocystidae) دارد بايد ميزبان نهايي آن يك گوشتخوار باشد. محققين تعداد زيادي از حيوانات و پرندگان را با مرحله كيستي انگل به طور تجربي آلوده كردند، اما نتوانستند اووسيست هاي انگل را به دست بياورند و همچنان ميزبان نهايي ناشناخته بود تا در يك بررسي اووسيست هاي انگل از دو قلاده سگ كه به طور طبيعي آلوده شده بودند، جدا شد و سگ به عنوان ميزبان نهايي انگل معرفي شد. مدتي بعد نيز اووسيست هاي اين انگل را از مدفوع چند قلاده كايوت جدا كردند و كايوت نيز به عنوان ميزبان نهايي انگل مطرح شد
 (Dubey 1992; Haddad et al. 2005 ).

از سال 1984 تا كنون شاهد پيشرفت هاي فراواني در زمينه يافته هاي جديد نئوسپورا بوده ايم، به طوري كه تا كنون مقالات زيادي در زمينه هاي مختلف نئوسپوروزيس از نقاط مختلف جهان منتشر شده است. در ايران نيز اولين بار سقط ناشي از نئوسپورا كانينوم در مشهد توسط رزمي و همكاران (2007) گزارش شد (Razmi et al. 2007 Dubey1999 b; ).

2-2– طبقه بندي انگل

تک ياخته نئوسپورا کانينوم در شاخه آپي کمپلکسا، رده اسپوروزوا، راسته اوکوکسيديدا (Eucoccidiidae) ، خانواده سارکوسيستيده، تحت خانواده توکسوپلاسماتينه (Toxoplasmatinae) و جنس نئوسپورا قرار دارد (1999 Hemphill).

3-2- سير تکاملي و ساختمان انگل

 نئوسپورا کانينوم انگل دو ميزبانه اجباري است (شكل 1-2). سگ و کايوت تنها ميزبان هاي نهايي شناخته شده براي نئوسپورا کانينوم هستند. سگ ها مي توانند هم ميزبان واسط و هم ميزبان نهايي انگل باشند. سير تكاملي انگل به سه مرحله تاکي زوئيت، برادي زوئيت و اووسيست تقسيم مي شود (et al. 2006 Dubey 2003b; Dubey  ).

اووسيست‌هاي انگل به همراه مدفوع ميزبان نهايي به بيرون منتشر و در محيط تحت شرايط مناسب (اكسيژن، رطوبت و درجه حرارت) در عرض سه روز هاگ دار مي‌شوند. داخل هر اووسيست، دو اسپوروسيست و داخل هر اسپوروسيست، چهار اسپوروزوئيت تشكيل مي شود. ابعاد اووسيست‌هاي هاگ دار حدود 7/11×3/11 ميكرون و اسپوروزوئيت‌ها 5/6×2 ميكرون است. اين اووسيست‌ها شبيه به اووسيست‌هاي توكسوپلاسما گندئي و هامونديا هاموندي (Hammondia hammondi) در مدفوع گربه و هامونديا هيدورني (Hammondia heydorni) در مدفوع سگ هستند كه جهت تفريق آنها از يكديگر استفاده از روش‌هاي ژنتيكي الزامي است (Dubey and Schares 2006 Dubey 2003b;  ).

اووسيست‌هاي هاگ دار انگل همراه با آب و مواد غذايي توسط ميزبان‌هاي واسط خورده مي‌شوند. اووسيست‌ها در روده، پاره و اسپوروزوئيت‌ها آزاد شده و پس از ورود به سلول هاي پوششي روده به تاكي زوئيت تبديل مي‌شوند. تاكي زوئيت‌هاي هلالي شكل به ابعاد 6×2 ميكرون هستند و به سرعت از طريق آندوديوژني تكثير مي يابند. تاكي زوئيت‌ها، سلول هاي عصبي، آندوتليال عروق، سلول هاي كبدي، ماكروفاژها، فيبروبلاست‌ها، ميوكارد و نيز تروفوبلاست‌هاي جفتي را در حيوانات آبستن مورد تهاجم قرار مي‌دهند. همچنين مرحله تاكي زوئيت‌ ممكن است از طريق جفت در حيوانات آبستن به جنين منتقل شود

 (Dubey and Lindsay 1993  et al. 2006; Dubey Barr et al. 1993;  ).

سيستم ايمني ميزبان مدتي پس از آلوده شدن ميزبان واسط بر عليه تاكي زوئيت‌ها كه داراي رشد و تكثير سريع هستند، تحريك و باعث حذف آنها از بافت‌ها مي شود. اين مرحله توسط برادي زوئيت‌هاي 8-7×2 ميكروني كه داراي رشد كندي بوده و در داخل سلول هاي ميزبان، درون كيست‌ها هستند، جايگزين مي‌شود. كيست‌هاي نئوسپورا كانينوم گرد تا بيضي شكل و بيشتر در سلول هاي عصبي و شبكيه چشم يافت مي‌شوند. اندازه کيست هاي بافتي ممکن است بسته به تعداد برادي زوئيت هاي داخل آن ها، بسيار متفاوت باشد. کيست هاي بافتي در سگ ها حدود 107 ميکرون قطر دارند و ضخامت ديواره آنها تا 4 ميکرون مي رسد.
کيست هاي بافتي در جنين گاو و گوساله هايي که به صورت مادرزادي مبتلا هستند در مغز و طناب نخاعي يافت مي شوند. اين کيست ها کمي بيش از 50 ميکرون قطر دارند و ضخامت ديواره آنها کمتر از 5/2 ميکرون است. تعداد کمي از کيست هاي